Primer dia:
Destinción de muestras con plata: (solo bandas Ag)
Mezclar 1:1, 30mM Ferricianuro de Potasio ( K3Fe(CN)6 ) : 100mM Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3)
- Lavar con 100 µl de H2O MQ.
- Lavar con 100 µl de solución ferrocianuro: tiosulfato. Dejar bandas en solución (5-10 min) hasta que las bandas se destiñen.
- Remover sobrenadante.
Lavado de las bandas:(todo tipo de teñido)
- Lavar con H20 miliQ
- Lavar con HCO3NH4 50mM
- Lavar con HCO3NH4 25mM , ACN 50%.
- Repetir paso 3 hasta que desaparezca el color azul
- Agregar ACN 100%, descartar y dejar secar en la mesada 5 minutos
Reducción y alquilación:
- Adicionar 50µl de DTT 10 mM en HCO3NH4 50 mM. Incubar 30 min a 56-60ºC. descartar (spin para sacar el condensado).
- Adicionar 35 µl de Iodoacetamida 55 mM en HCO3NH4 50 mM. Incubar 30 min en oscuridad a T amb y descartar.
- Lavar con 100µl HCO3NH4 50mM.
- Lavar con HCO3NH4 25mM , ACN 50%.
- Agregar 100 µl de acetonitrilo descartar y dejar secar al aire.
Digestión tríptica en GEL:
- Adicionar aproximadamente 12 µl de tripsina 10ng/µl en ácido acético 10mM a cada taquito, según su tamaño (que queden cubiertos los pedazos de gel) y dejar hidratando 10 min, 4°C (en hielo).
- Continuar agregando alícuotas de 2-5 µl, en caso de ser necesario, si no se hidrataron todos los pedazos de gel
- Agregar 10µl de bicarbonato de amonio 25mM
- Dejar incubando toda la noche a 37ºC
Segundo día:
Extracción de péptidos:
- Sonicar 5 min
- Extraer el exceso de liquido del digesto de la noche anterior; spin y depositarlo en un tubo limpio que contiene 5 ul de ACN 50%/TFA 0.5% (extracto a).
- Agregar 10-15µl de ACN 50%/TFA 0,5%.
- Mezclar, vortexear 10min
- Sonicar 5 min
- Spin, extraer el exceso (extracto b) y depositar sobre el extracto a.
- Repetir 3-5
- Extraer el exceso (extracto c) y depositar sobre el extracto a+b.
- Concentrar a seco 20-30 min en speed vac.