Primer dia:
Reducción y alquilación:
- Tomar una alícuota de muestra que contenga 0,4 ug/ul de proteina en HCO3NH4 50 mM (20 ug de proteina total).
- Adicionar 1 µl de DTT 1 M en HCO3NH4 50 mM. Incubar 45 min a 56-60ºC. (spin para sacar el condensado).
- Adicionar 2 µl de Iodoacetamida 550 mM en HCO3NH4 50 mM. Incubar 30 min en oscuridad a T amb.
- Adicionar 0,5 µl de DTT 1 M en HCO3NH4 50 mM. Incubar 10 min a 56-60ºC. (spin para sacar el condensado).
- Lavar con HCO3NH4 25mM , ACN 50%.
- Agregar 100 µl de acetonitrilo descartar y dejar secar al aire.
Digestión tríptica en Solución:
- Adicionar aproximadamente 1,5 µl de tripsina 100 ng/µl en ácido acético 10mM (relacion Tripsina/proteina 1/100 aproximadamente)
- Dejar incubando toda la noche a 37ºC
Segundo día:
Extracción de péptidos:
- Agregar TFA hasta pH igual o menor 4